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【活动回顾】浙江大学附属第一医院徐黎明《EBERs原位杂交检测的常见问题及质控要点》
发布时间：
2022-06-17
随着EBERs检测应用范围越来越广，检测技术逐步从手工走向了自动化。EBER检测的标准化、规范化以及质量控制越发引起行业关注。
6月11日，百凌生物举办的病理质控大家谈第二期直播课程中，浙江大学医学院附属第一医院徐黎明老师带来的《EBERs原位杂交检测的常见问题及质控要点》主题课程，从EB病毒及其致病原理、EBERs原位杂交检测方法及要点、EBERs检测在病理诊断中的应用三个方面，结合自身的工作经验，与大家分享了EBERs原位杂交检测中多种影响因素，实验中需要关注的要点，以及如何通过自动化仪器的使用以及使用新型阴阳对照品，从而实现EBERs原位杂交检测的自动化与标准化，提升检测的可靠性。
PART 1 影响EBERs原位杂交检测结果的关键因素
徐黎明老师认为组织固定、脱钙处理、酶消化修复、杂交条件等因素会对EBERs原位杂交检测造成一定的影响。
- 固定：及时、充分的固定不仅可以让EBERs保存得更好，定位更准确，还可以防止组织被过度修复。
- 脱钙：更温和的固定脱钙方式可以提升脱钙组织的EBERs检测效果和阳性率。
- 尽量使用温和的固定剂（比如骨髓组织使用不含苦味酸的固定剂）；
- 非酸性脱钙液（螯合剂替代酸液）；
- 脱钙时间适度；
- 冲洗要充分。
- 酶消化修复：过度修复致组织破坏严重，造成假阴性或无法判读。
- 杂交条件
- 切片杂交前酒精冲洗干片；
- 探针试剂杂交前复温；
- 杂交探针的量；
- 杂交时试剂封盖的程度；
- 杂交的温度和时间。
PART 2 EBERs原位杂交检测如何标准化
1、标准化实现方式之一，便是通过自动化仪器的使用。
徐黎明老师认为，自动化仪器的使用，可以完成从烤片到苏木素复染的全流程管理，有效避免了手工操作的复杂、繁琐、个体执行差异大的难题。此外，自动化仪器可以实现包括试剂管理及流程的追溯管理，易于实现质控体系管理。
2、标准化实现方式之二，是通过设置阴阳对照品。
为了保证每个检测样本均能被有效地判读，EBERs检测需设置阴阳对照。阴性对照，需选择确定无EB病毒感染组织标本。阳性对照，需选择阳性定位清晰、显色明显确定感染病毒的组织标本。然而，组织作为阳性样本，存在不易收集、单次实验使用量大，制备、使用及管理、所需工作量大，不利于广泛推广等缺点。由百凌生物开发的新型质控对照品，染色均一性好、可长期稳定供应、批间一致性高且使用便捷，可有效解决组织质控存在的难题。
PART 3 问答环节
Q1：手工做EBER，周五制作切片加探针到周一终止，再加抗体显色，对结果是否有影响？
A：杂交过程中不干片，影响不大；如果发现探针干掉的情况，需要充分冲洗或者用温水冲洗。
Q2：EBER液态细胞质控品，使用时在哪个步骤滴加比较合适？
A：捞片之后稍微晾干一下，再滴加液态细胞质控，然后进行烤片；滴加时切片上水太多的话可能会污染到组织。
Q3：原位杂交的时候，如何避免非特异性的背景？
A：不要特意拉长免疫组化流程中步骤的时间；可以对内源性过氧化物酶进行阻断，但是要慎重。
Q4：使用EBER液态细胞质控品，是否存在污染待检组织造成假阳性的风险？
A：污染风险的大小，很大程度上和操作有关；滴加液态质控后等到悬液干了之后再移动切片；染色过程中也存在液态质控脱落掉到组织位置的小概率事件，液态细胞质控有较高的识别度来鉴别。
Q5：液态细胞质控和液态组织质控，除了液态组织获取比较困难，还有什么别的区别？
A：两者各有优点；液态组织质控可以保留组织结构，可以帮助有经验的技术员判断切片质量；液态细胞质控细胞分布更均匀，没有细胞折叠的情况，不存在伦理限制，能够有效解决稀缺样本限制
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